免疫組化技術(shù)是當今廣泛應(yīng)用的檢測組織切片內(nèi)特定蛋白的實驗手段。利用圖像分析軟件來判讀切片圖像上蛋白表達程度是隨著軟件技術(shù)的發(fā)展逐步應(yīng)用到免疫組化技術(shù)中的。
組織上的蛋白表達程度，在圖片上表現(xiàn)為免疫染色的深淺及面積大小。用肉眼只能定性地進行判讀，較多粗略地作一個主觀的分級評價。使用圖像分析軟件則可以對圖片染色的程度作一個定量的測量。這個測量結(jié)果與切片上的蛋白表達強度有理論上的線性相關(guān)性。所以能客觀定量地反映它。
在圖像分析的方法中，使用灰度來表示一個點的明暗程度，而圖片上一個點的明暗程度是與切片上免疫染色物的“光學密度（OD，Optical Density ）”決定的，再往下追蹤一步，就是與組織切片上這個點的蛋白表達程度決定的。這有點類似于分光光度計的情形，比色皿里液體樣品的吸光度與液體中吸光成分的濃度相關(guān)，符合朗伯-比爾定律。圖片上一個點的光密度則與該點上的蛋白表達程度正相關(guān)（近似為正比）。所以測量一個點的光密度值，就是在測量這個點上蛋白表達程度的一個相對的量值。
朗伯-比爾定律：
A為吸光度,T為透射比,是投射光強度比上入射光強度
c為吸光物質(zhì)的濃度 b為吸收層厚度
請注意：郎伯比爾定律中的指數(shù)關(guān)系表現(xiàn)在吸光度A與透射率T之間。吸光度A就是光密度OD。它與樣品濃度是線性關(guān)系。所以圖片上光密度值與蛋白表達之間的關(guān)系理論上也是線性的。但它與灰度值之間的關(guān)系是指數(shù)的。因此，測量光密度值能更緊密地與蛋白表達程度相關(guān)，而灰度值則類似于透光率，它與蛋白表達程度的關(guān)系是朗伯比爾定律的反向的指數(shù)關(guān)系。這就是我一再強調(diào)要測量光密度值的原因。
在分光光度法中，我們需要作標準曲線來定量分析樣品的實際濃度，但在組織切片的情形下，是沒法作標準曲線的。所以我們只能測量到一個相對值。能對不同點的蛋白表達程度進行比較，但不能測量到這個點的蛋白量具體是多少微克。把一片區(qū)域內(nèi)所有的點的光密度值累加起來，就得到一個積分光密度（IOD, Integrate Optical Density ）。 圖片上一片片的染色斑塊的深淺與范圍反映了切片上的特定蛋白表達的程度，它可以由圖片上的積分光密度來相對定量地來表示。
無論使用什么圖像分析軟件，測量原理都是一樣的。就是測量圖片上一個區(qū)域內(nèi)的黃色染色物的積分光密度。但是具體測量哪些區(qū)域的積分光密度以及較后要如何作統(tǒng)計分析，就不是一個簡單的圖像分析問題了，而是與研究目標密切關(guān)聯(lián)的實驗設(shè)計問題。這也就是我無法說出該選擇什么樣的測量區(qū)域來計算區(qū)域面積與區(qū)域內(nèi)光密度值的原因。我只能總結(jié)出一個規(guī)律，就是要計算一個平均光密度指標來進行實驗組樣品與對照組樣品的統(tǒng)計比較。也就是計算出測量區(qū)域內(nèi)的積分光密度值，然后對這個區(qū)域的面積進行平均。以這個平均光密度值作為統(tǒng)計比較的依據(jù)。
示例：根據(jù)實驗設(shè)計選擇的測量指標：
直接比較整張圖片的積分光密度值。實際上測量面積就是整張圖片的面積。
比較特定區(qū)域的平均光密度值。在一張圖片上有許多區(qū)域的時候，可以只抽取其中部分試樣來測量的。這影響到的是抽樣量。當然，應(yīng)當盡可能地測量圖片上全部應(yīng)當測量的區(qū)域。
同一張圖片上不同的區(qū)域之間進行比較。這時候一張圖片上能得到一對數(shù)據(jù)，全部樣品測量數(shù)據(jù)可以作配對T-檢驗。
測量圖片上一個特定區(qū)域內(nèi)的平均光密度。注意選擇測量區(qū)域的時候，選得不太準不要緊，這仍然是個抽樣的問題，它對平均光密度值的影響是很小的。
測量區(qū)域就是染上了顏色的細胞，此時在測量黃色的IOD值的時候能同時測量出面積來。不必另外去選擇測量區(qū)域。根據(jù)實驗設(shè)計可以有多種測量指標供選擇：每個細胞的面積，積分光密度，平均光密度，照片上的細胞數(shù)量（其實就是細胞密度）等等。
在整個分析過程中，一般每張圖片測量出的只是一個平均光密度值，作為一個測量數(shù)據(jù)。一張切片則需要拍攝多張照片，這些照片各自的光密度平均值平均之后可以作為這張切片的測量數(shù)值。一個實驗樣品又可能會制作多張切片，所以較終一個樣品（一塊組織，一個動物，一個病例等）的測量數(shù)據(jù)就是所有這些照片的平均光密度值的平均值。在兩組實驗樣品的統(tǒng)計處理中，就是把每個實驗樣品的所有照片的平均光密度值再作一次平均，作為該樣品的測量數(shù)值。一組樣品的測量值再計算其平均值與標準差進行統(tǒng)計分析。對細胞核上蛋白的免疫組化測量有其特殊性。如果蛋白只在細胞核上表達，則不需要對核作藍染，切片上只有細胞核上有黃色染色物？梢灾苯舆M行分析測量。
在更多的情況下，對細胞進行藍染是必須的。只有染上藍色才能判斷細胞核的區(qū)域。但同時，藍染對細胞核的光密度測量造成了嚴重干擾。會導(dǎo)致光密度測量值的極大誤差。這時候用肉眼主觀判斷與圖像分析測量的結(jié)果基本上沒啥區(qū)別了。一個主觀的定量方法就是用肉眼判斷陽性細胞核與陰性細胞核，然后計數(shù)其比例作為一個定量的測量值。但這只適用于切片上有兩類細胞的情況。測量細胞核上的免疫組化圖片需要從染色開始就要考慮其分析測量過程。過程會比較復(fù)雜。這也相當于一個實驗方法的研究課題了。
關(guān)于使用熒光染料染色的熒光照片，使用圖像分析方法測量其熒光強度是不被提倡的。這并不是因為圖像分析軟件測量不了圖片的光密度，而是因為在熒光圖片的拍攝過程中，完全不能把切片的熒光強度正確地表現(xiàn)到圖片的光密度上。較終的定量分析結(jié)果恐怕還不如鏡下目視的判斷結(jié)果準確。
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